东说念主体细胞有好多机制来检测和应答细菌和病毒的入侵。识别细菌细胞壁因素的卵白质不错包裹在入侵细菌的名义，并行为信号卵白和抗菌酶拼装的支架。朱 等． 进行遗传、生化和结构实验，揭示这种大卵白复合物是何如变成的，并了解它是何如保护细胞免受细胞内感染的。低温电子断层扫描高慢，GBP1的单体和二聚体在细菌上变成均匀的涂层，中瓜分辨率的重建标明，彭胀的构象允许卵白质插入并摧毁细菌的外膜。——迈克尔·a·芬克和斯特拉·m·赫特利
结构化的详尽先容真核细胞的区隔景不雅为微生物病原体的保密和复制提供了各式种种的细胞内生态位。因此，真核生物进化出了室特异性免疫监视机制，教导宿主注视感染，并招募抗菌卵白，匡助限度微生物复制。好多这些宿主陷落卵白在际遇病原体或其居品时变成浩大的大分子复合物，以放大先天免疫信号，并在微生物识别位点的空间上定位卵白质伴侣。在某些情况下，好意思满的信号级联径直开荒在入侵病原体自己上，这是一种独到的情况，在这种情况下，一个浩大的外来物体充任了拼装通盘宿主陷落机制的锚定平台。这些浩大的宿主-病原体平台是如安在分子水平上启动和结构组织的仍然未知。
基应许趣自从十多年前在抗菌素和先天免疫信号复合物的物理拼装中被发现以来，鸟苷酸劝诱卵白(gbp)已成为动物和植物中庸碌的细菌、病毒或寄生虫的细胞内宿主陷落的主要组织者。在哺乳动物中，这些大型能源卵白样鸟苷三磷酸酶(gtpase)迁徙到细胞内病原体，在何处它们不错在微生物外膜(OM)上开荒大分子拼装，行为炎症卵白或杀菌效应物的互相作用中心，行为细胞自主先天免疫反应的一部分。为了更好地了解这些不同杂交结构背后的机制细节，咱们欺诈宿主和细菌遗传学以及单粒子纳米显微镜和低温电子断层扫描(cro - et)来不雅察革兰氏阴性细菌病原体名义的GBP陷落复合物。 和尚氏菌血清血清型鼠伤寒( 扫描纯正显微镜)，在东说念主类细胞的细胞质中。
终结咱们发现了一个多卵白陷落复合体径直拼装在 扫描纯正显微镜在东说念主体细胞内。这种陷落复合体包括东说念主类GBP眷属的四个成员(GBP1、GBP2、GBP3和GBP4)、东说念主类caspase-4过头自然底物之一全长Gasdermin D (GSDMD)。它通过caspase-4将GSDMD切割成其变成孔的亚基，从而触发先天免疫信号，导致免疫细胞因子白介素-18 (IL-18)的细胞外开释，并导致热一火细胞圆寂，这是违抗这种细菌病原体所必需的。值得注视的是，东说念主类GBP1是启动通盘信号级联的专性;它的基因去除欺压了剩余的免疫卵白被招募到革兰氏阴性细菌名义。c端锚定和gtpase驱动的自拼装使GBP1或者劝诱并在细胞质名义团员 扫描纯正显微镜开荒招聘平台。在短短几分钟内，近30，000个GBP1分子被拼装起来。用细菌小型细胞系统重建这个浩大的GBP1陷落复合体，不错在其自然情景下对通盘外壳结构进行低温电镜不雅察。在这个自然平台中，单个GBP1二聚体被发现接受灵通的构象，通过其延长的c端脂化尾部垂直插入细菌OM。站立的GBP1构象锚定导致OM摧毁，开释革兰氏阴性细胞壁因素脂多糖(LPS)，激活共拼装的caspase-4。
论断先天免疫信号级联的一个新兴规范是重复卵白质单元的高阶拼装，产生或者放大信号转导的大团员物。咱们的预计终结笃定东说念主类GBP1是主要的重复单元，每个芽孢杆菌额外千个卵白质，它资格了戏剧性的构象灵通，径直在革兰氏阴性菌名义开荒宿主陷落平台。该平台或者招募其他免疫伙伴，包括GBP眷属成员和炎性体路线的组成部分，它们在激活细胞因子(如插手素-γ)的下贱启动保护性反应。发挥这种浩大的分子结构不仅扩大了咱们对东说念主类细胞何如识别和扞拒感染的意会，何况可能对东说念主类群体中的抗菌方法也有影响。
在稽查器中掀开
摘抄。系数生物体都部署细胞自主陷落来扞拒感染。在植物和动物中，大的超分子复合物常常会激活免疫卵白以提供保护。在这项责任中，咱们科罚了无数宿主陷落复合物的自然结构，该复合物在东说念主类细胞内的革兰氏阴性细菌名义团员30，000鸟苷酸劝诱卵白(GBPs)。这个浩大的纳米机器的构建需要几分钟，并保握富厚数小时，需要鸟苷三磷酸水解，并招募了四个GBPs加上caspase-4和Gasdermin D行为细胞因子和细胞圆寂免疫信号传导平台。低温电子断层扫描标明，GBP1不错接受细菌插入膜的延长构象来开荒这个平台，触发脂多糖开释，激活共拼装caspase-4。咱们的“灵通一致性”模子为东说念主类GBP1陷落复合体何如动员先天免疫感染提供了一个动态的视角。
在生物系统中，环境信号常常通过配体诱导的细胞名义受体的变构变化来感知，这种变化速即将信号传递到里面，以转变所需的生理反应。在植物和动物的细胞自主陷落系统中(1，2)，额外的模式被用于解码外部寰球，包括通过螺旋对称变成的细胞内卵白质拼装(3，4)。这些高阶拼装通过卵白质团员或“朊化”事件放大先天免疫信号，以促进潜在酶原、半胱天冬酶和激酶的左近诱导自激活。这种重复瞎想的平正是多方面的:缩小信号阈值，全有或全无的反应性，以及富厚的信号体平台，不错招募和容纳无数的卵白质伴侣(3)。
这种产生延长的丝状信号平台的才略部分源于所波及的卵白质的模块化。信号小体卵白常常含有富含亮氨酸的重复结构域、半胱天冬酶激活和召募结构域(CARDs)，或通过协同作用将受体、适配器和效应器蚁合在沿途的圆寂效应结构域(3)。因此，它们在免疫激活细胞内产生一些最具秀雅性和可见的结构。这些包括视黄酸诱导基因I丝和线粒体抗病毒信号卵白朊病毒样结构，限度RNA传感;CARD和核苷酸劝诱域，富含亮氨酸(NLR)的卵白丝行为炎性小体机制的一部分;核因子κB和插手素(IFN)调控因子信号传导的核小体;和NLR hopz激活的抗性1五聚体，它们是植物抗性体的基础(3-6)。总的来说，这些大型团员物结构代表了在青年动物进化历程中细胞自主先天免疫的日益遍及的范式。它们的拼装形状不同于经典的抗原或免疫球卵白在质膜上的信号传导，后者常常通过集会的突触传递(3)。
在这一列表中，现时不错添加被称为鸟苷劝诱卵白(GBPs)的能源卵白样鸟苷三磷酸酶(GTPase)眷属成员，这些成员通过团员产生先天免疫信号平台和互助局部抗菌活性。GBPs在里面拼装成大型多聚体结构 拟南芥，斑马鱼，老鼠和东说念主类细胞，在某些情况下使用相分离来进一步浓缩同型复合物( 7- - - - - - 12)。在植物中，69- 122kda的gbp样卵白(GBPLs)反应可诱导的免疫信号，包括水杨酸和细果酸，在感染时代拼装大的核RNA团员酶II环节转录宿主陷落基因( 7， 8)。在动物中，免疫细胞因子如ifn诱导65- 73 kda GBP抒发，以限度免疫和非免疫细胞胞浆内的杀微生物或炎性体反应( 9- - - - - - 13)。这些行径常常与GBPs迁徙到微生物复制位点相一致，在何处它们满盈“包裹”指标病原体，以开荒中轨范信号传导或杀伤平台( 9， 12- - - - - - 16)。gbp包被病原体的大小范围从直径约750纳米到 和尚氏菌血清血清型鼠伤寒( 扫描纯正显微镜)至>5 μm 刚地弓形虫个( 17）.
拼装如斯大的外壳复合体必须获取与能源卵白(dynamic -like proteins， dlp)疏通的生化特色。dlp常常发扬出坚定的GTPase活性( k 猫， ~2 ~ 100分钟 ?1)，低微摩尔底物亲和力和核苷酸依赖的自拼装，在细胞内产生>0.5- 1-MDa复合物( 18， 19)。因此，它们是“大型”gtp酶，常常在囊泡运输、细胞器分裂或细胞质分裂历程中起机械酶的作用，使膜变形或管化( 18， 19)。东说念主类GBPs也发扬出很高的内在催化活性( k 猫， ~80分钟 ?1)以三磷酸鸟苷(GTP)为原料，经两步水解反应( 20， 21)。GTP水解可能引发构象变化，导致GBP二聚体的协同自拼装。在结构上，系数东说念主类GBPs都具有一个大的球状(LG) n端催化结构域和延长的α-螺旋c端尾部( 19);后者越过了包含α7 - α11螺旋的中间结构域(MD)和包含α12和α13螺旋的GTPase效应结构域(GED) ( 20， 22， 23)。在东说念主类GBP1和GBP5晶体结构中，GED紧密地折叠回LG和MD区域( 20， 22， 23)。这可能是一种阻塞的自扼制情景，因为在成例电子显微镜下，分离的GBP1的底物劝诱导致不同的几何神情( 24)。事实上，从表面上讲，底物催化不错开释GED，产生一个灵通的、活性的二聚体，并进行进一步的多聚，尽管在GTP水解后径直在病原体名义拿获的高分辨率GBP结构尚未报说念。此外，GBP1、GBP2和GBP5均具有c端CaaX基序，用于异戊二烯基修饰以促进膜劝诱( 19， 24)。异戊二烯化不仅不错提供锚定，还不错行为成核模板，使更多的GBPs千里积在微生物名义，从而在先天免疫历程中开荒信号平台( 12- - - - - - 16）.
在这项预计中，咱们欺诈冷冻电子断层扫描(cryo-ET)表征了一个由近30，000个GBP1分子拼装在细菌名义的大范围免疫陷落复合物。值得注视的是，尽管它们在植物和动物王国的宿主陷落中起着中枢作用(25-27)，但这些中轨范GBP外壳复合物在好意思满病原体膜上的超微结构组织现时尚不融会。在光衍射极限下可视化这些结构将增强咱们对真核细胞何如识别和扞拒感染的意会。它还将提供在自然条目下触发先天免疫信号的GBP1外壳拼装的信息。每一个都扞拒感染诊治以及东说念主类免疫识别和宿主陷落的基本生物学具有遑急意旨。
东说念主GBP1被毛大小、能源学和在纤维素中的富厚性咱们开首使用4Pi单分子开关(4Pi- sms)纳米显微镜和快速及时三维结构照显著微镜(3D-SIM)，欺诈配备高速振镜的OMX-SR Blaze成像仪器，检测了细胞质细菌周围的东说念主类GBP1外壳复合物。4Pi-SMS是一种双物镜、单分子定位、超分辨率显微镜，可在通盘哺乳动物细胞中以各向同性分辨率分辨~20 nm (200 ?)的3D结构( 28， 29);它使咱们或者检测到毒株名义的单个GBP分子 扫描纯正显微镜在东说念主体细胞内。使用OMX-SR仪器进行3D-SIM成像的速率可达每秒180帧，确保在通盘细菌封装历程中都能追踪涂层复合物的拼装。
咱们将GBP1行为东说念主类DLP眷属的前身。最近的预计发现，东说念主类GBP1召募到细胞质侵袭性病原体的外膜上，包括 扫描纯正显微镜和 弗氏志贺菌在IFN-γ激活的原代东说念主肠上皮、肌成纤维细胞和内皮细胞以及HeLa CCL2细胞中，载脂卵白L3 (APOL3)具有杀菌活性( 13)。咱们和其他东说念主也报说念了GBP1招募额外的GBP眷属成员和内源性东说念主caspase-4来刺激细胞因子开释[白细胞介素-18 (IL-18)]和原代肠说念东说念主类器官、东说念主巨噬细胞和东说念主上皮细胞系的焦一火( 12， 14- - - - - - 16)。因此，GBP外壳复合物已成为东说念主类细胞内宿主陷落和先天免疫信号传导的中心环节。
为了通过及时3D-SIM成像及时不雅察GBP1外壳复合物的变成，咱们使用CRISPR-Cas9删除了东说念主HeLa CCL2细胞中的内源性GBP1，并发愤能性单体红色荧光卵白(mRFP) -GBP1答复基因(GBP1)拔旗易帜 ——/ -mRFP-GBP1)在生理水平检测，以幸免过抒发伪影(图S1A)。当被感染 扫描纯正显微镜抒发增强绿色荧光卵白( 扫描纯正显微镜EGFP)， mRFP-GBP1在1 ~ 6分钟的时刻内满盈包裹了单个杆菌( 图1一个电影S1和S2)。在IFN-γ活化的GBP1中，内源性GBP1和GBP2在细菌名义的单分子4Pi-SMS成像也不雅察到全面涂层 +/+细胞，在某些情况下形貌了共定位( 图1 b和电影。GBP1的体积和能源学测量终结高慢，每个细菌以每秒103±11.6个分子的速率拼装29，542±5156个分子(图S1， B和C)。
这种快速的能源学需要无数的GBP1协同作用，包括GTP和GDP的礼貌水解，以终了GBP1二聚体在细菌名义核苷酸依赖的自拼装，正如功能丧失突变体所揭示的那样。GTPase(1英镑 S52N)， GDPase (GBP1) DD103，108NN)，或二聚化(GBP1) D184N)突变体在富厚重组的GBP1中阻断了外壳的变成和下贱IL-18的开释以及焦一火细胞的圆寂(如LDH的开释) - / -细胞( 10） ( 图1，C到H)。值得注视的是，这些n端突变体仍然在c端CaaX基序的翻译后戊基化( 图1 f(见图S2， A和B)，这可能有助于将GBP1固定在细菌外膜(OM)上。事实上，突变CaaX盒子(GBP1) C589S欺压C15法尼化和东说念主细胞内的外壳附着( 图1，F到H)。可是，通过使用过渡态雷同物GDP加氟化铝(AIF)的尺寸摈弃色谱高慢，它不会插手核苷酸依赖性二聚体的自拼装 3 - - - - - -)，重组卵白分析( 图1 e)。因此，GBP1突变体从随后的团员中解耦OM附着，揭示了革兰氏阴性感染免疫历程中衣壳复合物变成的不同方法。
OM锚定也需要一个多碱基贴片(氨基酸584至586)，雷同于小H-Ras gtpase中的脂质劝诱基序( 30)在GBP1 c端α-13螺旋内( 20)(图S2， A和B)。系数三种精氨酸的丙氨酸扫描诱变(GBP1 r584 - 586 a(31)被皮变成消融，下贱细胞因子和细胞圆寂信号通路受损( 图1 h和图S2， C和D) r584 - 586 a在东说念主类细胞内，被膜复合物拼装的丢失并不是因为r584 - 586a取代插手了隔邻CaaX基序的脂化( 图1 f)。违背，GBP1法尼化似乎是必需的，但对于OM的固定来说是不够的，需要第二个位点富厚地劝诱OM并匡助将其保留在细菌名义。
swag 肛交这种c端锚的二价性质在GBP1的脂多糖(LPS)劝诱谱中得到了加强 r584 - 586 a和1英镑 C589S从东说念主胚胎肾(HEK)细胞中纯化的枯竭内源性GBP抒发的突变体，以确保正确的法尼基连锁和后戊烯基加工( 32)(图S3、A和B)。脂多糖是革兰氏阴性OMs的主要因素(约75%) 扫描纯正显微镜） ( 33)，最近有报说念说，它能劝诱东说念主类GBP1 ( 15， 16)。咱们发现 扫描纯正显微镜在荧光各向异性实验中，LPS在生理pH和温度下拿获法酰化的flag象征的GBP1[解离常数( K d)， ~3.971 μM]，而未能拿获犯罪酰化的FLAG-GBP1 C589S非二聚体或催化突变体，或法酰化的FLAG-GBP1 r584 - 586 a(图S3B)。因此，GBP1与法尼基片断的拼装对于 扫描纯正显微镜脂多糖与精氨酸贴片的劝诱在静电上加强了这些互相作用，以保握涂层的富厚( 15， 16)。在某些情况下，这种富厚性情外握久:及时成像高慢，单个GBP1外壳不错在东说念主细胞质中握续长达2至3小时(图S3C)。因此，千千万万的GBP1分子一朝通过率先的法尼基和多基构兵锚定到细菌OM，就会产生一个高度握久的信号平台。
宿主和细菌决定因子GBP1包裹复合物拼装涂层的构建需要GBP1的c端附着和n端催化活性才能在通盘上团员 和尚氏菌名义。是否微生物的行径或细菌的物理特色也影响这一历程被工程学预计13 扫描纯正显微镜在大小、神情、开通性和OM因素上不同的菌株。 扫描纯正显微镜较长的分离株( 扫描纯正显微镜pBAD-ftsZ，最大可达20 μm)，更宽( 扫描纯正显微镜MreB K27E突变体，直径约2 μm)，或更小( 扫描纯正显微镜 Δ 心在IFN-γ -引物细胞中，直径为250 - 300 nm的小细胞仍然召募内源性GBP1，以激活IL-18的开释和热噬细胞圆寂( 图1，G和H)。波折 扫描纯正显微镜MreB D78V突变体通常转变了这一路线( 34， 35） ( 图1，G和H)。因此，微生物细胞的大小、分裂或曲率似乎不影响GBP1外壳变成以产生先天免疫信号平台。Flagellin-expressing ( 36)和鞭毛卵白枯竭 扫描纯正显微镜 ( 扫描纯正显微镜 Δ flhD)都被GBP1靶向，摈弃了开通性或细菌固定化行为出手外壳复合物拼装的陈迹。
因此，咱们转向OM自己。革兰氏阴性菌含有长多糖脂多糖链，变成二价阳离子交联樊篱，疏水溶质( 37)。LPS部分由o-抗原多糖、外核半乳糖、内核庚糖和3-脱氧- d -甘霖-辛糖酸(KDO)富集的糖类以及通过静电和疏水互相作用镶嵌在碱基上的多个酰基链的脂质a模块( 图1克)。同基因的 扫描纯正显微镜具有逐步变短的LPS链的突变体[通过在LPS生物合成路线的一语气方法中使酶失活而产生] ，38)]揭示了 扫描纯正显微镜 Δ wzy， 扫描纯正显微镜 Δ 瓦尔， 扫描纯正显微镜 Δ waaJ， 扫描纯正显微镜 Δ waaI，或 扫描纯正显微镜 Δ waaG不阻断GBP1外壳变成和下贱先天免疫信号传导( 图1，G和H）.
在这些截断的底下，咱们修改了位于OM底部的脂质A模块，在何处它与磷脂内小叶互相作用;脂质A被caspase-4识别并径直劝诱( 39)。突变 扫描纯正显微镜卵白LpxR， PagL，或PagP(去除一个3 ' -乙酰氧基片断)，去除一个单 R-3-羟基肉豆蔻酸链，或棕榈酰酸羟基肉豆蔻酸链)(40)未能欺压GBP1包被和caspase-4活化( 图1，G和H)。东说念主乙酰氧基水解酶(AOAH)的CRISPR-Cas9缺失 - / -)，它在HeLa CCL2细胞中低水平抒发，并行为失活机制从脂质A中去除二级酰基链( 41)，或东说念主E3泛素聚首酶无名指卵白213 (RNF213) - / -)，通过泛素化修饰脂质A ( 42)，对依赖于涂层的信号传导也莫得影响( 图1，G和H)。这么，功能性被毛就变成了 和尚氏菌主要受宿主GBP1活性限度，而不是脂质A修饰或细胞内(即活细胞内)的其他微生物决定因素。东说念主类GBP1仍然靶向细胞质 扫描纯正显微镜不管细菌大小、神情、活力或OM组成何如;后者越过了不同长度、电荷和化学结构的LPS链。这种庸碌的配体混杂可能有助于GBP1扞拒革兰氏阴性病原体，这些病原体修改其LPS片断，试图逃避先天免疫识别和抗菌杀伤。
东说念主类GBP1外壳启动了细菌识别的多卵白平台GBP1与细菌名义庸碌的多价互相作用为召募下贱卵白伙伴参与先天免疫信号传递提供了富厚的平台( 12， 13， 16)。咱们和其他预计小组先前的责任发现，GBP2到GBP4和caspase-4在原代东说念主肠说念类器官和宫颈上皮细胞系中组成了GBP1信号传导平台的一部分( 12， 16)。在本预计中，富厚的CRISPR-Cas9缺失证实了它们的遑急性，内源性caspase-4自身卵白水解(以活性p30亚基示意)、IL-18开释和IFN-γ激活的GBP1的焦一火细胞圆寂(行为LDH开释)显赫减少 - / -和2英镑 - / -单敲除和GBP1 - / -2 - / -双敲除细胞(图S4， A至C) - / -和4英镑 - / -可是，举座移除通盘335-kb东说念主类的效用较小吗 1英镑来 7英镑通过基因组工程对染色体1q22.2 (GBP)进行聚类 Δ1 q22.2)产生了险些满盈丢失的下贱信号，强调了协同GBP作用和表型复制CASP4 - / -和GSDMD - / -(气胚乳卵白D)细胞(图S4， A至C)。
好意思满的 英镑基因簇缺失在七倍GBP Δ1 q22.2突变体提供了一个瞎想的器用，不错在空缺布景下重建通盘外壳复合体，并测试GBP1是否是团结杆菌上该分层复合体的关键组织者(图S4D)。咱们纳入了全长GSDMD行为具有潜在杀菌活性的自然caspase-4底物( 43)，望望它是否也会被带到这个新的超分子平台上。每个涂层因素会通到七种荧光卵白中的一种[mAzurite， msapire， pmTurqouise2， pmEmerald， pmVenus， pmOrange， pmCardinal，或pmIFP24;荧光引发和辐照(E x/ E 米)范围(384/450至684/708 nm)，以笃定重组GBP的兼容组合 Δ1 q22.2行为exchange-PAINT的细胞枯竭合适的抗体来检测内源性卵白(图S4， D和E) 450 - 708)在感染90 ~ 120min后，收效地分离了五色物体，得到了一个好意思满的信号平台，GBP1到GBP4加上caspase-4或GSDMD都掩盖在团结杆菌上( 图2，A至C，图S4、F、G)。
值得注视的是，当GBP1被忽略时，这种多色外壳满盈隐藏了，这标明GBP1从一出手就开荒了通盘信号级联( 12， 14） ( 图2、A、D)。实在是英镑大衣 450 - 708实验发现，东说念主GBP1对同期分享团结细菌名义的GBP2、GBP3、GBP4和caspase-4或GSDMD具有专性( 图2 d)。摈弃caspase-4对GBP1和GBP4莫得影响，将它们置于上游，但它在很猛进程上阻断了全长GSDMD的靶向，将其定位在这个六成员信号级联的下贱，行为两步分层模子的一部分( 图2，C至F)。值得注视的是，模拟加工底物的N端或c端GSDMD片断未能被招募( 图2 e)。因此，一朝卵白酶在被GBP1召募后被脂质A激活，caspase-4似乎只将其全长GSDMD底物带到该位置进行切割;这在单独删除的CASP4中也得到了证实 - / -或1英镑 - / -细胞( 图2 f)。通过追踪该路线中另一个主要的caspase-4底物pro-IL-18，咱们发现它在很猛进程上未能被招募到外壳上。因此，GSDMD是GBP-CASP4信号复合物的新组成部分，是两步分层模子的一部分( 图2 f)。它与caspase-4的互相作用可能发生在到达GBP平台之前，正如GBP的共免疫千里淀试验所高慢的那样 Δ1 q22.2细胞( 图2 g）.
LPS劝诱谱进一步复古了该分层模子( 图2 h)。FLAG-GBP1， -GBP2， -GBP3， -GBP4或-caspase-4 C258A(注重自身卵白水解)( 39)从东说念主HEK细胞中纯化，以幸免细菌羞耻，并确保卵白质经过翻译后修饰;1英镑( K d， ~3.776 μM)和caspase-4 C258A ( K d， ~313 nM)与 扫描纯正显微镜脂多糖是主要的OM劝诱卵白( 13， 14， 39） ( 图2 h)。因此，GBP1是这种多卵白复合物的主要组织者，位于被包裹的细菌的顶部( 12， 16)。它的拼装促进了细菌通过caspase-4识别LPS脂质A片断，这不错招募GSDMD行为激活细胞圆寂和下贱细胞因子开释的后续方法。
GBP1陷落复合体在纤维素和重组系统中触发细菌LPS开释GBP1外壳复合物何如促进caspase-4对LPS的识别，极端是讨论到脂质A埋在OM的底部，仍然是一个问题。咱们开首探伤了活菌在纤维素( 图3、A、B)。开首是铜(Cu 2 +) free CLICK化学试剂用于象征 扫描纯正显微镜含有Alexa Fluor的LPS通过kdo叠氮化物繁衍物在内核内与脂质A相邻( 图3)。反 和尚氏菌o抗原抗体用于考据KDO-Alexa荧光信号，该信号在传递到细胞质溶胶历程中减少。咱们通常将荧光d -丙氨酸加入到L-Ala-D-中 内消旋-diaminopimelate-D-Ala - O-Ala五肽通过代谢象征活性细菌中潜在的肽聚糖(PG)支架( 44） ( 图3)。3D-SIM发现，好意思满的GBP1涂层触发了LPS的开释，但似乎并莫得插手LPS的开释 扫描纯正显微镜IFN-γ活化HeLa细胞胞浆内PG层( 图3 b)，证实了GBP1不错促进细胞中caspase-4配体的可用性。其他外显结构，如鞭毛，在gbp1包被的细菌( 图3 c);因此，GBP1主要影响OM的摧毁，使PG支架和鞭毛器官保握好意思满。
接下来，咱们径直检测脂质A的开释，以测试GBP1是否确满盈以开释LPS。咱们使用无细胞重构系统来测量可溶性脂质a，由于宿主细胞质被通盘细菌羞耻，因此不可在原位进行。法尼化重组RFP (rRFP) -GBP1的无菌孵育 扫描纯正显微镜发现时添加GTP底物后60 min内，>95%的细菌被满盈包被( 图3 d)。细菌被rRFP-GBP1包封遵从一个高度加快的s型弧线，产生最大值的一半(“外衣”) K 米)，坡度为5.122 ( 图3 e)。值得注视的是，这种全有或全无的行动不是由越过相变界限引起的，因为rRFP-GBP1不相分离，不像植物gbpl，在感染时代具有c端固有杂沓词语区域产生生物分子凝合物( 6， 7)(图5a)。显著的涂层，不管 扫描纯正显微镜大小或LPS情景;与革兰氏阴性比较 Pseuodomonas绿脓杆菌和革兰氏阳性 单核细胞增多性李斯特氏菌终结标明，后两种细菌的rRFP-GBP1包封水平较低(图S5、B和C)。
值得注视的是，GBP1涂层复合体的重构引发了 扫描纯正显微镜脂多糖开释，通过鲎试剂(LAL)测定，检测可溶性脂质A片断。Unfarnesylated rRFP-GBP1 C589S法酰化的催化或拼装突变体不可被包裹 扫描纯正显微镜即使在加入GTP后也不可开释LPS，模拟了在东说念主细胞内不雅察到的终结( 图3 f)。遗漏GTP或用不可水解的GTP雷同物(GTP-γ-S或GMPPNP)或过渡态模拟物(GDP)取代GTP。淌若 3 - - - - - -或GMP。淌若 4 - - - - - -)也未能触发rgbp1依赖性LPS开释，因为这些雷同物不可复古水解驱动的GBP1在细菌上的包被( 图3 f)。gtp依赖性rGBP1拼装开释的脂质A量 扫描纯正显微镜大大杰出了 K dcaspase-4 ( 39)，但占总LPS的比例<1%[基于2 × 10] 6每个LPS分子数 扫描纯正显微镜 ( 31)]。因此，GBP1外壳复合体摧毁LPS外叶;根据这种摧毁的进程，它可能与炎性体激活以至细菌杀死同期发生( 13， 15)。事实上，rGBP1与东说念主rAPOL3共孵育会导致细菌活力的丧失( 图3 g)，因为GBP1的OM中断允许APOL3访谒 扫描纯正显微镜底下的内膜( 13)。用不可水解的GTP-γ-S或GDP证实了这种依赖性。淌若 3 - - - - - -不仅欺压了rGBP1外壳的变成和LPS的开释( 图3 f)以及随后的rapol3介导的杀伤( 图3 g)。因此，东说念主类GBP1的插入似乎摧毁了LPS-LPS的横向互相作用，从而挫伤了OM的好意思满性。这不仅激活了caspase-4炎性体通路，何况允许小的抗菌卵白如APOL3通过，径直杀死致病菌( 13）.
细菌小型细胞系统使低温电镜和低温et的自然GBP1外壳咱们重组的外壳复合体为咱们提供了不雅察GBP1拼装和插入细菌外小叶以触发LPS摧毁的契机。使用矫健的成像器用，如冷冻电子显微镜(cryo-EM)和冷冻电子显微镜(cryo-ET)，不错描述出GBP1的构象。咱们瞎想了细菌渺小胞和外膜囊泡(OMVs)，因为它们比等基因杆状杆菌小得多，但与东说念主工脂质体或可溶性LPS不同，它们保留了病原体OM的好意思满特征( 图4)。更值得注视的是，微孔厚度的减小栽培了低温et样品的分辨率( 34)，阴性染色电镜初步证实了这小数 扫描纯正显微镜迷你细胞和omv像亲本细胞一样被rRFP-GBP1包裹 扫描纯正显微镜1344菌株(图S6， A和B)。
小细胞是由不合称的细胞分裂( 图4);咱们发现一个分离基因的过度抒发， ftsZ，产出最小 扫描纯正显微镜渺小胞(~150-300 nm)，与omv沿途差速离心仍然不错分离好意思满(图S6C)。咱们特地先容 ftsZ过度抒发 waaG枯竭LPS o抗原和外核段( 扫描纯正显微镜 Δ waaG::pBAD-ftsZ)，因为这些片断具有非结构化密度，会插手亚层析成像平均( 45)，移除它不错让咱们在OM插入点隔邻看到更多的原生GBP1二聚体。由于脂质A区仍然好意思满，o抗原和外核片断对于GBP1外壳附着和东说念主类细胞内的下贱信号传导亦然必不可少的( 图1，G和H)。因此，咱们瞎想了双重遗传计谋，合计止在冷冻et采集歪斜图像时的非特异性样本噪声。
Cryo-EM在200 kV下收效地重建了GBP1包被复合物 扫描纯正显微镜 Δ waaG::pBAD-ftsZrfp - gbp1±GTP ( 图4 b初步的电磁测量发现，GBP1的范围约为25至27 nm，紧密地并置于通盘细菌名义(图S6E)。在最近的一项预计中，法酰化的东说念主类GBP1与不可水解的GTP雷同物GMPPNP (PDB ID 6K1Z)劝诱的晶体结构中，该卵白的长度是这个长度的一半(12.89 nm) ( 22)，临了的α13螺旋折叠回到α12 c终端，变成一个“阻塞”的构象(图S6， E和F)。用低温电镜测量，要越过~25到27 nm，至少需要两个垂直放弃在相互顶部的“阻塞”GBP1分子，或4到6个水平排列并垂直于外层小叶的分子( 46)。另外，AlphaFold2建模( 47)发现GBP1可能资格其GED的动态c端延长，从而将满盈脱链的C15法尼基呈现给OM(图S6F)。这个“灵通”彭胀的共形骸的瞻望长度为278 ?，这也合适EM测量终结。每个潜在的构型都通过冷冻- et和生化凭证进行探伤，以笃定在自然条目下，当信得过的底物GTP存在时，GBP1是何如径直作用于细菌名义的。
Cryo-ET揭示了数千个灵通的GBP1构象插入到细菌OM中接下来，咱们使用300千伏冷冻- et在剂量分级模式下获取满盈拼装在细菌名义的东说念主类GBP1外壳复合物的高对比度3D图像( 图4，C到H(图S7， A至L)。rRFP-GBP1荧光率先匡助咱们定位了玻璃化样品中的包被杆菌，RFP的连锁并莫得改变GBP1的总长度(图S6F)。在30，483次测量中发现了~280 ?的平均构象长度 扫描纯正显微镜 Δ waaG::pBAD-ftsZ和 扫描纯正显微镜 Δ 心小型电板加上omv ( 图4、C、D，电影S4和S5)。从细菌名义放射出的细长的GBP1构象在屡次断层扫描中可见( 图4，E到H，图S7G)。在粗分类历程中采集的44，891个颗粒中，有15，683个颗粒用于该自然宿主陷落复合物的三维分割( 图4、G、H)。它领会了一层浩大的外衣 扫描纯正显微镜 Δ waaG::pBAD-ftsZ直径达384纳米的小型电板(电影S6)。放大后的视图高慢，当聚首到OM时，似乎垂直站立的GBP1构象常常在寄存器中对皆( 图5）.
为了考据这种自然包被中的单个卵白质结构，咱们接下来使用无标签的rGBP1来确保RFP不会插手横向包装，并在12858个颗粒上应用更紧密的最终掩膜进行亚断层图平均(STA)(图5B和图S8， A至C)。这种立异需要用户端剧蓝本顺应未象征的GBP1的小尺寸(68 kda)，其纯真性和细菌OM上的密集阵列。使用这种计谋，咱们不错科罚更大的1英镑二聚体过头较小的单体的亚基~ 9到17径直在细菌名义(图5，C和D，和无花果。S9， A到D)。在这些决议，LG，医学博士，时代不错规则区域(图5 D和无花果。S9， A到C)。土产货1英镑接受非对称二聚体LGs误解和相对歪斜时附着在细菌OM(图5 D)。这可能雷同于在东说念主类GBP1结晶二聚体(PDB ID 7E5A)中发现的歪斜LGs(23)，尽管α12和α13 GED螺旋延长到自然GBP1的LPS内核和脂质A区，产生最小长度为22.4 nm(图5，D和E)。因此，咱们的冷冻et分析产生的一种可能性是东说念主类GBP1在其功能情景下行为“灵通”的构象(图5E);这与迄今为止报说念的系数单体或二聚体GBP晶体结构变成对比，后者将GED置于“阻塞”构象中(图5E)。
列举这些自然构象和细菌名义累积在于每个亚层析图段，以及总体尺寸测量 扫描纯正显微镜 Δ waaG::pBAD-ftsZ在小细胞中，咱们发现存11，760±735个GBP1卵白集会在OM上，产生>1-GDa的结构。为进修的棒状 扫描纯正显微镜，这推断出每个细菌约有22，000至32，000个GBP1分子，这与早期的原位光学显微镜估量一致。因此，Cryo-ET为这种浩大的免疫复合物提供了一个新的结构视图，其中数千个GBP1二聚体可能将其c端GED结构域延长到280 ?，以锚定法尼基尾并插入隔邻的多基贴片。
这种中轨范外衣在原位也很显著。聚焦离子束(FIB)研磨片层与联系光学和电子显微镜(CLEM)沿途在东说念主细胞内发现了gbp1包被的细菌(图S10， A至D) 扫描纯正显微镜pBAD-ftsZ在150 ~ 300 nm的fib磨薄片层中检测旷费的包被事件，以及在GBP中检测EGFP-GBP1的抒发 Δ1 q22.2布景确保它是独一靶向杆菌的GBP眷属成员(图S10A)。这种双重计谋收效地科罚了逃遁到胞质溶胶中经过clem考据的细菌上的GBP1外壳复合物;空泡的 扫描纯正显微镜枯竭EGFP-GBP1行为阴性对照(图S10， B至D，图S11， a和B)。在这种分辨率下无法描述单个GBP1二聚体;可是，~30 nm的EGFP-GBP1界限周围 扫描纯正显微镜与无细胞测定中重组被膜的长度格皮毛似(图S11A)。因此，在体外不雅察到的构象变化可能在细胞中起作用，产生了无数的GBP1陷落复合体。
GBP1陷落复合体装置构象能源学模子通过三种不同的方法进一步考据了东说念主GBP1的构象能源学模子。开首，咱们瞎想了礼貌洗涤条目，以减少卵白质在外壳复合体里面的拥堵。它使咱们或者不雅察到分离的GBP1二聚体仍然附着在 扫描纯正显微镜体外omv和小型细胞( 图6、A、B，图S12， A和B)。66个分离的GBP1卵白的断层扫描图像发现，系数的GBP1卵白都有球状的LG位于周长，延长的C端锚定在底部;这些分离的二聚体跨度为25.08 ~ 27.44 nm，标明其构象彭胀了( 图5，D至F，图S12， C和D)。其次，纳米金象征考据了这一取向。咱们选拔1.8 nm的ni - nta纳米金颗粒劝诱组氨酸标签(His) 6)会通到GBP1的n端LG，用于检测其在进修外壳内的位置。标签只在外界限( 图6 c)，这与LG位于外衣的顶部是一致的，正如分离的二聚体( 图6、A、B)。值得注视的是，在莫得His的情况下，走漏的细菌OM不可劝诱纳米金颗粒 6-GBP1，标明象征信号来源于卵白质自己( 图6 c)。试图引入一个函数His 6由于存在用于法尼化的CaaX基序和用于OM锚定的多碱基R584至586A序列，因此在GBP1 C端隔邻的序列被说明是不切实践的。尽管如斯，洗净的omv和纳米金象征的冷冻- et都证实了GBP1二聚体在革兰氏阴性细菌名义的长度和场所。
临了，通过半胱氨酸替代试验评估了GBP1 GED动态灵通的要求。七个配对的半胱氨酸(Cys)突变体(I369C-E533C、E366C-G530C、I365C-H527C、R362C-E526C、I365C-G526C、G361C-S523C和G389C-K520C)越过c端GED α12螺旋过头空间相邻的α7 MD螺旋，终融会“阻塞”构象的二硫交联(图S13A);这欺压了c端α12，13区域掀开到~280 ?，除非走漏于还原剂如二硫苏糖醇(DTT)。为了确保引入Cys-Cys对不会导致除掀开c端搭钮外的总体结构改变，咱们开首测试了它们是否仍然不错靶向 扫描纯正显微镜在东说念主类细胞质的还原环境中。系数7对Cys-Cys包被细胞质 扫描纯正显微镜HeLa细胞(图S13B)。在这些突变体中，咱们选拔了Cys-Cys间键长度最短的中间R362C-E526C突变体(2 ?)，在原位阐明其平常活性后，制作重组RFP-GBP1进行径直无细胞包衣实验( 图6、D、E在莫得DTT的情况下，“阻塞”的二硫化物聚首的R362C-E526C构象满盈不可涂覆 扫描纯正显微镜即使赐与GTP底物，与野生型rRFP-GBP1对照( 图6 f)。可是，添加DTT满盈收复了R362C-E526C突变体( 图6 f)。因此，生化凭证复古东说念主类GBP1二聚体需要动态掀开至~280 ?才能在细菌名义拼装。C15法酰化的尾部将GBP1锚定在OM上，催化LG结构域位于旯旮，以产生这种独到的宿主陷落平台。
盘考高阶卵白组合有助于放大先天免疫信号，并通过在配体识别位点定位伙伴来在空间上调换信号传播(1，3)。这种组合变成于宿主质膜、线粒体、过氧化物酶体和叶绿体上(1，48)。它们也发生在细胞质、细胞核、内质网和内体蚁集中，在某些情况下，通过液-液相分离产生无膜凝合物(49)，正如最近在细胞自主陷落细菌植物病原体历程中发现的植物gbpl(7，8)。
比拟之下，东说念主类的GBP1在一个满盈目生的物体，革兰氏阴性细菌OM上构建了一个多卵白复合物。这个浩大的纳米机器将GBP2、GBP4、caspase-4和全长GSDMD行为一个六成员平台的一部分，在多种东说念主类细胞类型中传播细胞因子和细胞圆寂信号( 10， 16)。咱们发现东说念主类GBP1是这个平台的中心组织者，并像DLP超眷属的其他成员一样，欺诈核苷酸依赖的水解来自拼装( 18)。gtp驱动下的GBP1协同性呈s型弧线 扫描纯正显微镜在125 nM以上急剧加快的细菌上的涂层弧线，雷同于其他“优先化”卵白质，一朝达到浓度阈值，就会发生全或无反应( 3)。锚定在LPS上可能有助于加快GBP1的催化和寡聚( 16)。GTPase和GDPase活性都通过GTP和GDP的转变(行为两步酶促历程的一部分)来促进GBP1的反应性( 15， 21)。由于GTP和GDP的水解开释了无数的吉布斯目田能，因此GBP1外壳通过“作念功”来开荒这个浩大的信号平台，从而合适纳米机器的要求。这也许不错解释为什么像GDP这么的过渡情景类比。淌若 3 - - - - - -不可在好意思满的细菌上重现原生被毛( 15)，尽管它能匡助GBP1变成二聚体( 20， 21)。违背，需要多轮GTP和GDP水解来握续驱动相邻二聚体的拼装，这些二聚体可能资格横向互相作用以富厚涂层。Cryo-ET标明，这些横向互相作用可能是由gtp诱导的误解LG自己的变化引起的，因为GBP1二聚体在镶嵌自然外壳复合物时发扬出微弱的不合称。
GTP水解的功能遑急性被其触发gbp1依赖性LPS开释的才略进一步加强，后者激活caspase-4并使细菌对apol3介导的杀伤( 13)。通常，过渡情景(GDP)。淌若 3 - - - - - -， GMP。淌若 4 - - - - - -)或不可水解的雷同物(GTPγS或GMPPNP/GppNHp)未能引起gbp1依赖性的OM摧毁以开释LPS。这些终结强调了使用底物模拟物来探伤GBP1陷落复合物在病原体名义的变成和功能的局限性，尽管它们在早期分离的GBP1预计中很有效( 20， 21， 24）.
Cryo-ET为咱们提供了对于GBP1过头在革兰氏阴性上的超分子结构的结构信息 和尚氏菌名义处于自然情景。先前的GBP1晶体结构使用的是在 大肠杆菌拿获单体(载脂卵白)情景±GMPPNP ( 20， 22)。细菌中产生的n端g结构域在多个不可水解核苷酸(GMPPNP， GDP)存鄙人也结晶为同二聚体。淌若 3 - - - - - -， GMP。淌若 4 - - - - - -、及GMP) ( 21)。两种全长的东说念主GBP1晶体结构都将α12和α13 GED螺旋折叠在α7和α11 MD上，而在自然条目下，咱们发现时东说念主细胞中产生的重组GBP1是满盈拉伸的，α12和法酰化的α13螺旋垂直插入细菌的外小叶。笃定一个“灵通的”GBP1构象行为进修外壳复合体的主要重复单元，加强了冷冻- et的才略，以深远了解拼装卵白质在其自然膜指标上和自然底物存鄙人的行动，在这种情况下，底物是GTP ( 50）.
咱们试图科罚拼装在其生理名义上的GBP1陷落复合物的尝试在两个轨范上说明是具有挑战性的:开首，GBP1二聚体的小尺寸(~140 kDa)，其次，最终团员物的大尺寸~1.5 gda。在数千个疏通的卵白中笃定单个GBP1分子的长度和取向为9.7 ?不仅得益于获取后装潢，还得益于细菌遗传学和重组卵白制备。纯化的150- 300纳米渺小胞和厚度减少的omv有助于栽培歪斜图像的质料。进一步通过基因去除o抗原和外核来注重非结构化LPS密度插手GBP1 c端分辨率( 45)。部分保密在里面小叶中的GBP1的GED不错从断层扫描中重建，以匡助阐明动态灵通模子。使用快速卵白液相色谱(FPLC)径直从东说念主细胞中纯化的法尼化GBP1也确保了正确的OM锚定和插入。C15脂化需要通过东说念主法尼基转变酶进见礼貌添加，通过CAAX羧化肽酶去除三肽，然后通过异戊酰半胱氨酸羧化甲基化酶( 32)。因此，后戊烯基加工使满盈修饰的法尼基尾部险些与三精氨酸贴片相邻(相距三个氨基酸)，变成矫健的两部分锚。多基基序的OM插入可能与带负电荷的PO发生静电互相作用 4 - - - - - -脂质A基团和内核糖，而法尼基化使尾部更疏水( 15， 16)。总之，这些修饰使东说念主GBP1的STA与革兰氏阴性细菌劝诱。现时咱们也曾开荒了检测纤维素中gbp1包被细菌的出手条目，它应该有助于扫视fib研磨的东说念主细胞的层析密度。
咱们的低温et三维重建发挥了一种独到的宿主陷落结构的中轨范结构，即无数的GBP1外壳复合物，它在东说念主类细胞质内的微生物病原体名义协同起作用。咱们的预计终结加强了高阶卵白质拼装在动植物先天免疫系统中的遑急性。这些纳米机器浓缩信号和效应卵白，用于快速动员细胞自主违抗感染。
材料与方法抗体和试剂抗体使用的抗体有抗flag M2 (F1804， Sigma)、抗ha (16B12， Biolegend)、抗myc (9E10， ThermoFisher)、抗gfp (11814460001， Roche;A0174， Genscript)，抗gst (1E5， Origene)，抗dsred (sc-390909， SCBT)，抗gbp1 (sc-53857， SCBT)，抗gbp2 (sc-10581， SCBT)，抗- 和尚氏菌O B组抗血清(240984，BD)、抗鞭毛卵白(flic1， biolgend)、抗β-肌动卵白(ab6276， Abcam)、抗gapdh 41335;SCBT)，抗il -18 (PM014;MBL)，抗caspase-4(克隆4B9;Enzo)和抗gsdmd (NBP2-33422， Novus Biologicals)。应用见表S1。
试剂GTP钠盐(G8877)、GTP-γ-S(四锂盐;G8634)， GDP钠盐(GDP;G7127)、GMP钠盐(GMP;G8377)，三氟化铝(449628)，氯霉素(220551)，Ficoll (F5415)和生物素(B4501) (Sigma /微孔);鸟苷-5′-[(β，γ)-亚胺]三磷酸(四锂盐)/GMPPNP/GppNHp (Jena Biosciences;ν- 401 - 50);重组东说念主IFN-γ (285-IF/CF;研发系统;285——淌若); 明尼苏达州和尚氏菌LPS-Alexa Fluor 488 (ThermoFisher;L23356)。
菌株细菌菌株由里面产生或由以下组提供: 好意思国血清血清型鼠伤寒( 扫描纯正显微镜)菌株1344和鞭毛卵白枯竭 扫描纯正显微镜 Δ flhD (Dr. Jorge Galan); 扫描纯正显微镜UK-1野生型，Δ wzy，Δ 瓦尔，Δ waaJ，Δ waaI，Δ waaG，Δ lpxR，Δ pagL，Δ pagP， χ11088 ( 扫描纯正显微镜 ΔlpxRΔpagLΔpagP三重突变体)(Roy Curtiss III博士，Soo-Young Wanda博士)( 38， 40）; 铜绿假单胞菌L2菌株(Barbara Kazmierczak博士) 枯草芽孢杆菌(法伦·艾萨克斯博士) l . monocytogenes140203S (Herve Agaisse博士)。
以下 扫描纯正显微镜菌株在1344等基因布景上构建: 扫描纯正显微镜 Δ心， 扫描纯正显微镜pBAD::ftsZ， 扫描纯正显微镜mreB (K27E)， 扫描纯正显微镜mreB (D78V)， 扫描纯正显微镜mScarlet-I， 扫描纯正显微镜eGFP． 此外， 扫描纯正显微镜。 ΔWaaG::pBAD-ftsZ在UK-1布景下为cryo-ET生成。详见表S2。
生成 扫描纯正显微镜对UK-1中的MinD缺成仇MinD/waaG双缺失突变体，接受lambda红色重组酶系统。引物minDKO-L (GTTTACGATTTTGTAAACGTCATTCAGGGCGATG cgactgtgtaggctggggcttcccc)和minDKO-R (ggagatgttcttaatcggttcttcccc attttctcatgggaattagccatggtccccgcccca)扩增出具有minD侧翼序列的卡那霉素卡带 ）以pKD4矢量为模板。将团员酶链反应(PCR)居品凝胶索取并电穿孔至野生型UK-1和waag缺失型UK-1 扫描纯正显微镜受体细胞抒发红色重组酶。选拔卡那霉素(Km)耐药菌株，接受minD Km插入考据引物minD-Km- l (ATTTTGTAAACGTCATTCAGGGCG)和minD-Km- r (gcagttcattcagggaccg)检测卡那霉素插入minD基因。使用引物minD- wt - l (GCTGATCAAAGATAAGCGTACTGA)和minD- wt - r (CGATGCCAGAATACCCAG AATACG)检查minD缺失区域。
细胞培养和转染HeLa (CCL-2)和293T (CRL-3216)细胞购自American Type Culture Collection (ATCC)。细胞在添加10% (v/v)热灭活胎牛血清(FBS)的DMEM中助长，37℃，5% CO 2孵化器。慢病毒(LentiCrisprV2;附加基因质粒#52961)或逆转录病毒(pMSCV-puro;转染的293T细胞经0.45 μm过滤的上清液用8 μg/mL聚苯乙烯孵育24小时，完成Takara 634401)的转导。为选拔富厚的转导剂，以1 μg/ml嘌呤霉素为步伐。对于瞬时转染， 反式它 ?-LT1 (MIRUS;MIR 2300)按照制造商的说明使用。为了尽量减少显微镜实验中的毒性，每24孔盖滑动转染200 ng DNA。用500 ~ 1000 U/mL IFN-γ刺激HeLa细胞18小时。
CRISPR-Cas9细胞系与富厚互补为了在HeLa CCL2细胞中产生富厚的基因敲除，按照既定的有野心将单指引rna (sgRNAs)克隆到pX459 (Addgene质粒#62988)中。每个基因靶向2 ~ 4个sgRNAs(总DNA为200 ng)转染24孔板，用1 μg/mL嘌呤霉素筛选48小时。将存活细胞在不含嘌呤霉素的培养基中扩增48小时，然后进行有限稀释以获取单个菌落。先用PCR法筛选菌落，再用Western blot法筛选，每个阳性克隆用Sanger测序法笃定基因型。产生了以下10个CRISPR-Cas9突变体 - / -， 2英镑 - / -， 3英镑 - / -， 4英镑 - / -， 1英镑 - / -2英镑 - / -双突变体，GBP D1q22.2七重突变体 - / -2英镑 - / -3英镑 - / -4英镑 - / -5英镑 - / -6英镑 - / -7英镑 - / -)， CASP4 - / -， GSDMD - / -， AOAH - / -， RNF213 - / -． 表S3提供了用于产生这些CRISPR缺失的向导rna (grna)的好意思满列表。
此外，咱们生成了一系列细胞系，富厚或移时地补充了GBP突变体、亲和探针或答复基因。包括GBP1 - / -克隆系补充以下任一:EGFP-GBP1、RFP-GBP1、mg - gbp1、EGFP-GBP1 S52N， EGFP-GBP1 DD103，108NN， EGFP-GBP1 D184N， EGFP-GBP1 C589S， EGFP-GBP1 α的arr 13， EGFP-GBP1 α13 rar， EGFP-GBP1 α13基本， EGFP-GBP1 α13 ara， EGFP-GBP1 α13 aar， EGFP-GBP1 α13 aaa(r584 - 586 a)。本文根据Stratagene Quickchange (Agilent 200523)契约，引入了GBP1 c端多碱基贴片(氨基酸584 ~ 586)的丙氨酸扫描突变，并通过DNA测序进行了证实。质粒转染到GBP1进行互补 - / -根据制造商契约，使用Mirus LTI对海拉细胞进行检测。简便地说，将1 μL的Mirus LTI加入到50 μL无血清DMEM中，然后分别加入500 ng的构建物。将搀杂物静置30分钟，然后通过移液轻轻搀杂。在耐嘌呤霉素的GBP1上选拔耐潮霉素的细胞 - / -海拉细胞布景。
咱们也补充了CASP4 - / -EGFP-caspase-4和GSDMD - / -EGFP- FL-GSDM， EGFP- nt - gsdmd或EGFP- ct - gsdmd。后一种质粒也被引入CASP4 - / -和1英镑 - / -荧皎皎微镜下的无性系见上图。
细菌感染，LDH测定，和IL-18 ELISA为 扫描纯正显微镜在崭新Luria肉汤(LB;Thermo 12780029)，培养3小时，然后在PBS中洗涤一次，用于在80%的合度下感染HeLa细胞，感染倍数(MOI)为20至50，如图所示。1000倍离心10分钟 g在37°C下孵育30分钟，以使细胞浸润。用含有100 μg/ml庆大霉素(Thermo 15710064)的崭新DMEM (Thermo 11965092)替代培养基，杀死细胞外细菌30 min。细胞洗涤3次，并用20 μg/ml庆大霉素孵育。为了成列活菌，细胞在PBS + 0.5% Triton X-100中裂解，并在LB琼脂上一语气稀释。LDH测定接受CytoTox 96?非放射性细胞毒性测定法(Promega G1780)测定细胞圆寂。接受东说念主IL-18酶联免疫吸附测定试剂盒(Abcam;ab215539)，检测灵巧度为8.3 pg/mL。
点击化学和代谢象征法尼基焦磷酸(FPP) -叠氮化物-生物素CLICK化学抒发GFP或GFP- gbp1突变体构建的293E细胞(ATCC HEK CRL-1573)以2 × 10的倍率被镀 5六孔板中每孔中的细胞。然后用20-μM Azido farnesyl焦磷酸(Cayman C10248)处理细胞18小时，然后用500 μL 20- mm Tris(7.5)、100-mM NaCl、1%含有罗氏卵白酶扼制剂的TX-100缓冲液裂解细胞。细胞进一步在冰上超声(30%功率Virtis Virsonic 600，每次1分钟3次)，以开释膜劝诱卵白。裂解物在21000℃离心 g将上清液转变到新的Eppendorf管中，在室温迷蒙条目下，用100-μM Biotin dibenzocyocytynol (Thermo C10412)处理过夜。每个IP中加入1 μg罗氏单克隆抗gfp抗体，4℃孵育2小时。在每个反应中加入20 μL预均衡的Protein G Sepharose (Cytiva 17-0756-01)，再加2小时。珠子在4000度时成球 g5分钟后在裂解缓冲液中冲洗8次。加入100 μL的2X SDS-Sample Buffer洗脱样品，100℃加热20 min进行免疫印迹。用链亲和素hrp和罗氏抗gfp进行免疫印迹。
KDO-azide铜2 +目田点击化学日记阶段的KDO 扫描纯正显微镜根据坐褥商说明书(耶拿生物科学)，用点击介导法进行象征。简便地说，引入双正交叠氮基团对KDO的c8位进行叠氮修饰，以注重KDO-8- p磷酸酶的反向代谢。这种8-叠氮-8-脱氧- kdo修饰使DIBO烷基染料中间体(Jena Bioscience CLK-A105P4)中的生物素基团通过Cu(I) free CLICK化学引入，以添加Alexa Fluor 594标签(Jena Bioscience CLK-1295)。在感染实验中，咱们对也曾将荧光象征的d -丙氨酸劝诱到肽聚糖支架中的细菌进行点击化学反应，使用500 μM的hcc -氨基- d -丙氨酸(HADA;多国评价hy - 131045)。未掺入的DIBO通过PBS无数洗涤去除。
Stm肽聚糖代谢象征及脂多糖在纤维素中的开释荧光蓝色或红色d -丙氨酸雷同物[hc -氨基- d -丙氨酸，HADA (MCE hay -131045);TAMRA 5-氨基- d -丙氨酸使用5-羧基四甲基罗丹明(ab145438)]按形貌( 46)。MOI 20时HeLa细胞感染。感染40 min后改为DMEM加100 μg/mL庆大霉素，1 h后改为30 μg/mL庆大霉素。感染后2小时用PFA固定细胞，对GBP1或LPS进行免疫染色。使用DeltaVision采集至少10个gbp1阳性和10个gbp1阴性视线 TMOMX SR Blaze显微镜系统(GE Healthcare)， 3D-SIM模式(512 × 512像素，曝光1毫秒，125纳米步进，8 z片，每片15张图像)。系数图像都经过宽视场图像、反卷积和最大强度投影处理，以便在CellProfiler中进行半自动分析(Broad Institute， Open Scholar， 2021)。
显微镜3D-SIM和多色共聚焦显微镜HeLa细胞在12 mm高性能掩盖玻璃(Thorlabs CG15KH1)上助长1.5h，用于固定样品的显微镜不雅察。为了进行及时成像，将细胞接种在四孔室(Cellvis C4-1.5H-N)上，使用1.5高性能掩盖玻璃。在这里，播撒发生在成像前48小时，在感染本日达到80%的会通度。成像前赐与IFN-γ诊治18 - 24小时。在MOI为20的情况下，将细菌添加到感染细胞中。图像在一台三角电视机上进行分析 TMOMX SR Blaze显微系统(GE Healthcare)或激光扫描共聚焦模子SP8(徕卡)。
对于超快及时成像，GBP1 - / -用RFP-GBP1转染HeLa细胞，用1000-U/mL IFN-γ诱导18小时，然后用EGFP-感染 扫描纯正显微镜在MOI 20。40分钟后，将培养基改为含有30 ug/mL庆大霉素的DMEM，并在感染后60分钟出手在37°C， 5% CO下成像 2． 使用OMX-SR Blaze显微镜(GE)在3D-SIM 512 × 512像素模式下，以~180帧秒的速率每45 s采集一次图像 ?1． 图像示意云纹条纹图案反卷积z堆栈的最大强度投影(Softworx， GE)。使用Imaris(牛津仪器)软件进行及时体素(盒装)拼装事件的采集后筹商。劝诱使用Voronoi细胞算法筹商的GBP1 (PDB ID 1F5N)和RFP (PDB ID 1GGX)的三维原子结构体积( )，筹商每体素中空间受限RFP-GBP1分子的总额，以及涂层能源学。欧氏Voronoi细胞算法或者估量千里积卵白质结构(PDB)中系数原子的堆积密度，筹商原子的范德瓦尔斯球内的体积，原子的溶剂摈弃体积，以及卵白质中不错容纳水分子的每个空腔的位置和近似半径，从而获取好意思满的体积信息( 51)。此外，还包括了3D-SIM荧光对gbp1包被细菌的EM体积的赔偿比，因为前者不不错与EM疏通的精度领会物体。3D-SIM体积平均大3.02倍( n= 17)，比径直免疫电镜测量值高。因此，将3D-SIM体积除以3.0以改造荧光增强。遥远成像接受低光OMX-SR常范围式，以5分钟停止一语气纪录长达2.5小时(图S3C)。
用于检修GBP-COAT 450 - 708咱们构建了不同光谱范围的荧光会通卵白GBPs1-4、caspase-4和GSDMD，以同期容纳5个或6个卵白 扫描纯正显微镜． 将6个外壳卵白分别与以下荧光答复卵白会通，生成60个卵白的彩色编码矩阵:mAzurite- c1 (Addgene质粒#54583)、mt -蓝对峙-c1 (Addgene质粒#54545)、pmTurqouise2-c1 (Addgene质粒#60560)、pmEmerald-c1 (Addgene质粒#53975)、pmVenus-c1 (Addgene质粒#27794)、pmmorange -c1 (Addgene质粒#54680)、pmKeima-Red-c1 (Addgene质粒#54546)、pmCardinal-c1 (Addgene质粒#54546) # 54799)， pmApple-c1(添加基因质粒#54631)和mIFP24-c1(添加基因质粒#54820);E x/ E 米范围:384/450至684/708 nm。简而言之，从ifn α处理的HeLa细胞cDNA等分别扩增出GBP1、2、3和4引物。用Caspase-4 cDNA (Sino Biologicals #HG11158-M)和pET-SUMO-hGSDMD (Addgene，质粒#111559)的引物分别扩增Caspase-4和GSDMD。扩增子被克隆到答复质粒中 萨尔我/ BamHI为止性内切酶消化。对系数构念进行测序以进行考据。多阵列测试发现pmIFP24-GBP1、pmOrange-GBP2、pmvenous - gbp3、pmEmerald-GBP4、Sapphire-caspase 4或-GSDMD的五种组合，或pmOrange-GSDMD不错收效地与 扫描纯正显微镜．
GBP-COAT 450 - 708根据制造商的说明，用转染试剂(Mirus Bio)将组合转染到GBPD1q22.2七倍突变体中。24小时后，用IFN-γ激活细胞16 ~ 18小时，并用spi1诱导的病毒感染细胞 扫描纯正显微镜SL1344在MOI = 5~10条目下孵育30 min，再与100 μg庆大霉素孵育50 min，以脱色胞外细菌。用激光扫描共聚焦显微镜(SP8， Leica)捕捉五色或六色荧光图像。如图S4E所示，使用一系列激光器来引发这个宽波长的荧光，并幸免漏出。所使用的相应激光参数(激光、%功率、波长招揽波段)为:pphire(二极管405、4、424 ~ 444)，pmEmerald(二极管470、20;490至520)，金星(WLL 516，6;pmOrange (DPSS 561， 25，566至593)，pmIFP24 (HeNe 633， 75，680至730)。欺诈LAS X软件(徕卡)对图像进行三维重建。
4 pi-sms nanoscopy对于4Pi- sms成像，使用一种定制的显微镜，在两个相对的高na物镜周围开荒一个垂直的4Pi腔，如其他地方(28)详实先容，用于拿获IFN-γ激活的HeLa细胞中GBP外壳复合物的高分辨率图像。细胞样品在直径为25mm的圆形精密玻璃盖片(Bioscience Tools， San Diego， CA)上制备，浸入1M KOH中，并在超声波清洗机(2510 Branson， Richmond， VA)中超声15分钟。在milliq水(EMD Millipore， Billerica， MA)中纪律洗涤，并用70%酒精消毒，然后干燥并将盖子涂上聚赖氨酸。在4%多聚甲醛(PFA)中固定前，HeLa细胞在盖片上助长24至48小时。Anti-GBP1 (1 b1;圣克鲁斯;1:500稀释)和GBP2 (1E5;Origene;1:200稀释)抗体在室温下用山羊抗小鼠Fab AF647 (Jackson ImmunoResearch， PA)和山羊抗兔IgG CF660C (Biotium， CA)在1:200稀释下象征2小时。
1B1抗体针对全长GBP1卵白，而抗gbp2抗体针对一个n端17个氨基酸的肽表位。这使得两种抗体都能劝诱它们的内源性GBP靶标，因为n端LG指向外壳复合物的顶部。特异性在IFN-γ活化中得到证实 Δ1 q22.2，英镑1英镑 - / -或2英镑 - / -HeLa细胞行为阴性对照:系数细胞在单分子水平上未象征。欺诈这种时期，至少不错在胞质细菌上检测到几百个GBPs，常常是400到800个分子。自然这个数字在无细胞系统中只占cryo-ET成列的总额的2%到3%，但当1B1抗体染色用于无细胞的gbp1包被细菌时，它给出的数字通常很低。因此，抗体可及性(由于被膜的精细性)和较大的二抗检测是为止因素。现时市面上还莫得效于GBP1或GBP2的纳米体。可是，值得注视的是，与体外比拟，这种比较忽略了在纤维素中具有较少GBP外壳卵白的细菌，因为当用疏通的多克隆抗体象征时，两者的终结相似。
样品安装、图像采集和数据处理主要按照前边形貌的方法进行( 29成像速率为200 Hz， 642 nm激光强度为~12.5 kW/cm 2． 常常，纪录3000×100~200帧。DME用于漂移改造。使用Vutara SRX 7.0.06软件(Bruker， Germany)，接受点飞溅模式(20 nm粒径)画图系数4Pi-SMS图像。
重组卵白的纯化GBP1到GBP4过头突变体caspase-4C258ARFP-AtGBPL1将东说念主GBP1过头突变体的编码序列克隆到定制载体pCMV-His中 10-Halo-HRV-mRFP-TEV用于涂层分析。HEK 293F悬浮细胞(James Rothman博士的礼物;支原体阴性)浓度看护在0.4 × 10 6~4 × 10 6细胞/m在Expi293抒发培养基(ThermoFisher A1435101)中。转染前24小时，以1.2 × 10的浓度接种细胞 6细胞/毫升。转染时，采集细胞，在2.5 × 10浓度的崭新培养基中重悬 6细胞/毫升。加入pCMV-His转染细胞 10在含PEI浓度为5 μg/ml的培养基中，含halo - hrv - mrfp - tev的克隆终浓度为1 μg/ml。转染24小时后，用含有4-mM丙戊酸的崭新培养基1:1 (v/v)稀释细胞，再培养2天。2 × 10 9通过离心(500倍)采集细胞 g， 10分钟)，在冷PBS中洗涤一次，在裂解缓冲液(50 mM HEPES， pH 7.5， 500 mM NaCl， 1 mM MgCl)中重悬 2， 10%甘油，0.5% CHAPS， 1mm TCEP)，通过超声裂解。细胞在35000倍下被祛除 g在4℃下放弃1小时。采集上清液，与1 ml床体积的HaloLink树脂(Promega G1912)在4°C下安宁旋转孵育过夜。用洗涤液1 (50-mM HEPES， pH7.5， 500 mM NaCl， 1 mM MgCl)纪律洗涤树脂两次(每次10分钟) 2(10%甘油，0.5% CHAPS)，洗涤缓冲液2 (50 mM HEPES， pH7.5， 1m NaCl， 10%甘油)，然后洗涤缓冲液1。
为了洗脱劝诱卵白，Halo树脂在裂解缓冲液中重悬，用自制的GST-HRV-His卵白酶在4°C下安宁旋转消化过夜。将树脂制成颗粒，通过Ni-NTA珠亲和层析(QIAGEN 30210)从上清液中去除HRV卵白酶。通过采集、浓缩、进一步纯化顺心冲交换，通过尺寸摈弃色谱(Superdex?200 Increase;GE Healthcare)用储存缓冲液[20 mM HEPES (pH 7.5)， 150 mM NaCl， 1 mM MgCl]均衡 2[1 mM TCEP]。馏分经SDS-PAGE分析，搀杂、浓缩并在液氮中快速冷冻，然后在-80°C保存。rRFP-tev-hGBP1(简称rRFP-hGBP1)卵白浓度通过BCA和SDS-PAGE电泳测定，BSA步伐品备用。
重组东说念主GBP1、GBP2、GBP3和GBP4以及GBP1突变体(hGBP 1 s52n， hGBP1 D184N， hGBP1 DD103，108LL， hGBP1 C589S和hGBP1 R3A)，分别克隆到哺乳动物抒发载体pCMV-3Tag1A (Agilent 240195)中，带有n端FLAG标签。东说念主类caspase-4 C258A克隆到pcDNA 3.1/Hygro (Thermo V87020)中，用于n端FLAG聚首。质粒通过Mirus LT1转染到HEK-293 E细胞中。14小时后得益细胞，在50 mM Tris， 150 mM NaCl， 5 mM MgCl缓冲液中裂解2小时 21 mM DTT，含1% Triton X-100和卵白酶扼制剂。含有抒发卵白的上清液通过抗Flag M2亲和凝胶(Sigma A2220)，劝诱的Flag卵白用Flag肽150 μg/mL洗脱，缓冲液为50 mM Tris， 150 mM NaCl， 5 mM MgCl 2和1mm DTT。在AKTA FPLC (GE Amersham)仪器上进行进一步的色谱纯化。系数在东说念主细胞中制备的重组卵白均经LAL (ThermoFisher A39552)检测，证实不存在LPS羞耻(<0.01 EU/mL，最低检出限)。
粒径摈弃色谱法他的。 6-象征的GBP1或GBP1突变卵白按上述方法制备。FPLC在配备Superdex 200 10/300 GL尺寸摈弃柱(GE Amersham)的AKTA系统上进行。用5个体积当量的缓冲液[20 mM Tris (7.5)， 140 mM NaCl， 2 mM MgCl]预均衡柱后 2]，检测各重组GBP1卵白100 μg。然后用20 mM Tris (7.5)， 140 mM NaCl， 2 mM MgCl交换和均衡柱缓冲液 2，内含200 μM GDP-AlF 4 - - - - - -在过渡态模拟物存在的情况下测试GBP1拼装。在280 nm处测量吸光度，并在保留时刻内生成色谱仪。
薄层色谱法薄层色谱(TLC)用于分离GTP、GDP和GMP，并满盈按照前边所述( 7- - - - - - 9)。简而言之，α- ( 32P]GTP (Perkin Elmer BLU006H250UC)在反应缓冲液中水解[20 mM HEPES (pH 7.0)， 150 mM NaCl， 5 mM KCl， 1 mM MgCl] 2， 100 μM GTP， 10 μCi α-( 32P) GTP]在25℃下测定，反应7小时后用142 mM EDTA淬火。所得居品接受PEI纤维素(Sigma， Z122882)，荧光指令剂(UV 254)，用750 mM KH进行分离 2阿宝 4(pH 3.5)行为溶剂，通过放射自显影。
LAL用于OM摧毁试验中脂质A检测Overnight-cultured 扫描纯正显微镜与指定扼制剂在37°C下摇匀预孵育2小时。3500转/分钟室温离心20分钟后，用10倍体积的涂膜缓冲液[50 mM HEPES (pH 7.5)， 150 mM NaCl， 1 mM MgCl]洗涤3次 2临了用含GTP (2mm)、GTPγ s (2mm)、GMPPCP/CppCp (10mm)、GDP的涂布缓冲液(1ml)重悬。淌若 4 - - - - - - (2?mM GDP， 200?μM AlCl 4(10mm NaF)或GMP。淌若 3 - - - - - - (2?mM GMP， 200?μM AlCl 3， 10 mM NaF]。用或不加4 μM重组GBP1或其突变体在30℃下孵育1小时。仔细采集上清液，离心(8000 rpm， 22°C， 2 min)，稀释1:1000至1:5000。开释的LPS接受毒素传感器显色LAL内毒素测定试剂盒(GenScript L00350)，按照坐褥厂家说明进行测定。
LPS-binding化验东说念主类GBP1， GBP2， GBP3， GBP4， GBP1突变体(GBP1 S52N， 1英镑 D184N， 1英镑 DD103，108LL， 1英镑 R53A，以及GBP1 C589S)和caspase-4 C258A这些卵白在东说念主胚胎肾(HEK)-293E细胞中抒发为Flag象征卵白，并使用上述Flag M2珠从大范围贴壁细胞培养等分离出来。重组东说念主卵白进一步用FPLC纯化为单峰。在37°C下，在不同GBP浓度的劝诱缓冲液[50 mM Tris， 150 mM NaCl， 5 mM MgCl]中进行荧光各向异性测定 2， 0.3 mM GDP和AlF X (10 mM NaF， 0.3 mM AlCl 3)， pH 7.0]和Flag- caspase-4 C258A(50 mM Tris， 150 mM NaCl， 1 mM DTT， pH 7.0)浸泡15分钟，然后加入 和尚氏菌明尼苏达州LPS-Alexa Fluor 488至终浓度250 nM。LPS孵育1小时后，用SpectraMax i3x (Molecular Devices)测量荧光各向异性值。
重组涂层试验野生型 扫描纯正显微镜和 扫描纯正显微镜突变体在LB板上新涂上条纹。单个崭新菌落在LB培养基中37℃培养过夜。在包衣试验之前，将细菌在崭新LB培养基中稀释1/60，再培养2小时，离心(4000)得益 g， 22°C下5分钟)。为了去除扼制rRFP-hGBP1靶向的零碎LPS，细菌在涂膜缓冲液[50 mM HEPES (pH 7.5)， 150 mM NaCl， 1 mM MgCl]中洗涤两次 2]并进一步稀释到光密度(OD) 600)在涂层缓冲液中为0.1。涂布前立即在室温下解冻rRFP-hGBP1，并在12，000℃下离心 g浸泡15分钟，去除不溶性集会体。包衣时，在每0.1 OD的细菌中加入2 μM rRFP-hGBP1和2 mM GTP，轻轻搀杂，在22℃下孵育1小时后成像。
为了对rrfp - hgbp1包被的细菌进行成像，将包被反应(20 μL)转变到384孔玻璃底板(Cellvis;p384 - 1.5 h - n)。该板在2000℃离心 g1分钟将系数液体采集到井底。系数图像均接受徕卡SP8激光扫描共聚焦显微镜，63×/1.40油浸物镜。焦平面确立在井底。RFP在561 nm处引发，590 ~ 610 nm处检测。光学切片以共聚焦模式(1 Airy单元)获取，平均扫描6次。图像采集神情为512 × 512。使用FIJI/ImageJ进行图像分析。
对于涂层复合物拼装，样品从2 μM rRFP-GBP1出手加倍稀释，直到涂层隐藏，开荒涂层弧线。用最好拟合插值画图了不雅察到的行动，并出现了一条s型弧线。使用graphpad Prism 9.1.1进行弧线拟合并进行牵挂分析，得到半最大值和Hill斜率值。
重组杀虫分析对于细菌杀灭试验， 扫描纯正显微镜在LB培养基中助长至中对数相，洗涤后用5 μM hGBP1在涂膜缓冲液(50 mM HEPES pH 7.4， 150 mM NaCl， 5 mM MgCl 2)含或不含2mm GTP， 2mm GTPγ s或GDP。淌若 4 - - - - - - (2?mM GDP， 200?μM AlCl 3， 10毫米NaF)。 扫描纯正显微镜然后在含有5 μM rAPOL3的缓冲液A [50 mM MES pH 6.0， 100 mM葡萄糖酸钾(KGluc)]中制成球团并重悬，在37°C下孵育1小时，然后镀在LB琼脂上计数集落变成单元(CFU)，一式三份。
体皮毛分离rRFP-GBP1和rRFP-GBPL1 ( 7)，室温解冻，14000 ×离心 g静置5分钟，去除任何集会的卵白。将卵白稀释到低盐缓冲液(50 mM HEPES， pH7.5， 150 mM NaCl， 1 mM MgCl)中诱导变成液滴 2)与不同体积的无盐缓冲液[20 mM HEPES (pH 7.5)， 1 mM TCEP]搀杂，并在室盖玻璃(Grace Bio-labs)中使用Lecia SP8激光扫描共聚焦，放大倍数为63×/1.40。添加5、10、15和20% w/v的Ficoll对rRFP-GBP1莫得影响。
电子显微镜负染色电子显微镜为了不雅察rRFP-GBP1在小型细胞上的作用，将100 μL小型细胞洗涤并溶化在HEPES缓冲液(pH 7.4)中至OD 600就是0.1。将渺小胞悬液与终浓度为2 μM的rRFP-GBP1在22°C下，在GTP存在或不存在的条目下孵育1小时。将搀杂物浓缩至10μL，进一步进行透射电镜不雅察。将5 μL RFP-GBP1包覆和未包覆的小型电板装入发光碳膜包覆的铜EM网(EMS， CF400-Cu-50)上静置1分钟。EM网清洗，用2%甲酸铀酰染色30 s。网格用滤纸(Whatman filter PAPERS 2;1002-090)，干燥1分钟。在JEOL1400 +电子显微镜下不雅察栅格，加快电压为80 kV。
Cryo-ET在EM网格上进行细胞播撒电磁网格的预处理。电磁栅格(Quantifoil R1/4 gold 200 mesh， Q250AR-14)放弃在18 mm上 2盖玻璃已洗净，并储存在100%酒精。然后将其置于玻璃底皿(Cellvis， 35 mm皿，20 mm微孔盖玻璃)中，用70%酒精在22°C紫外线映照下处理10分钟。电镜网格用无菌除气水洗涤6次，然后用0.05 mg/mL I型胶原(Gibco， A10644-01)在37°C培养箱中处理60分钟，然后用除气/蒸馏水洗涤。胶原包被的网格在DMEM培养基中，在37°C、5% CO的培养箱中孵育过夜 2供进一步使用。
英镑的 Δ1 q22.2在10 cm培养皿中培养7个突变体，培养密度为4 × 10 6每盘细胞数。将EGFP-GBP1质粒转染HeLa细胞，使用Mirus LT1试剂盒进行过夜抒发。随后用PBS洗涤细胞，并用0.05%胰卵白酶- edta处理以使细胞脱离。分离的HeLa细胞离心，用DPBS缓冲液重悬，然后用40 μm尼龙网过滤器(Fisher Scientific， 22363547)过滤，以去除较大的碎屑。将过滤后的HeLa细胞悬液转变到5 mL聚苯乙烯圆底管(康宁，352235)中，用细胞过滤帽进行FACS分选。gfp阳性细胞分选到采集管中，离心后重悬至最终细胞密度为2 × 10 4DMEM中添加10%胎牛血清和100 μg/mL Pen Strep (Gibco， 15140-122)。将抒发egfp - gbp1的细胞接种到预处理的EM网格上，进一步孵育过夜。对于感染试验， 扫描纯正显微镜pBAD-ftsZ0.2% l -阿拉伯糖诱导，培养至OD密度 6001.0，在MOI 200感染。涂有英镑的电磁栅极 Δ1 q22.2HeLa细胞和细菌细胞进一步在800℃离心 g5分钟，将细菌旋转到HeLa细胞名义。电镜网格转变到37°C培养箱中再孵育20分钟，然后用DPBS洗涤三次，用满盈DMEM加100 μg/mL庆大霉素再孵育1小时。
用于制备小型细胞 扫描纯正显微镜 ?念念想在LB培养基中添加100 μg/mL氨苄西林，37℃下培养过夜。将10 mL细菌过夜培养物加入1 L崭新LB培养基中，在氨苄西林的存鄙人，培养到log期后期。然后分批培养在:(i) 6240下进行3步离心 g(Beckman coulter， Avanti JXN-26， rotor， JLA-8.1000) 10 min，去除亲本杆状杆菌;(2) 24820 g(转子，JLA-16.250) 10 min，采集渺小胞组分，重悬于HEPES缓冲液(pH 7.4)中，用0.45 μm PVDF膜(Merck Millipore， SLJVM33RS)过滤;(3) 20000 g(转子，JA-25.50)再静置10分钟。将微孔组分调整至OD 6001.0为rRFP-GBP1体外包被。
用于制备小型细胞 扫描纯正显微镜 ΔwaaG::pBAD-ftsZ崭新培养物在含有100 μg/mL氨苄西林和0.2% l -阿拉伯糖的LB培养基中一语气培养 FtsZ37℃诱导20小时。 扫描纯正显微镜 ΔwaaG::pBAD-ftsZ按照上述方法采集小型细胞。
玻璃化和低温联系荧皎皎微镜(CLEM)。用荧皎皎微镜事前筛选抒发egfp - gbp1的HeLa CCL2细胞的EM网格，夹在定制的手动柱塞上，用whatman# 1滤纸(GE， 1001-110)进行染色，并用柱塞将其冷冻在液态乙烷中。将冷冻网格转变到冷冻台上，并夹在o形环和c形环内(分别为ThermoFisher Scientific， cryo-FIB autogrid和c形夹)。Cryo-CLEM (Leica Microsystems EM Cryo-CLEM显微镜)按照前边形貌( 7)。栅格被转变到与预冷航天飞机对接的Leica-CLEM筒中，然后转变到配备预冷40倍物镜的低温级上。一个古迹 ×考中4个网格区域，对16个子区域进行成像。接受Z-stack模式，在0.35 μm的步进范围内获取蒙太奇egfp阳性图像。这个蒙太奇行为导航图，在随后的磨粉试验中通过聚焦离子束方法。
用FIB铣削薄片将Cryo-CLEM分手的网格转变到配备冷冻级和冷冻转变穿梭系统的冷冻双束显微镜(Thermo Fisher Scientific， Aquilos冷冻fib聚焦离子束/扫描电镜)。薄片按照Aquilos冷冻fib有野心制备。在网格o形环一侧的样品上溅射镀有铂(1 kV， 30 mA， 10 pa， 15 s)，以栽培样品在FIB铣削历程中的导电性。在从cryo-CLEM导入荧光蒙太奇之前，使用MAPS软件在电子束模式下拿获EM网格蒙太奇，以生成合并图，以开荒研磨片层的潜在指标。对指标区域的中心高度进行了细化，笃定了片层的阶段歪斜角为16°。在网格上的指标位置，用气体喷射系统(ThermoFisher Scientific， GIS)喷涂有机金属铂涂层5秒。
率先，从顶部以300pa电流出手粗磨，并以小的逐步形状络续进行。同期，用扫描电镜不雅察细胞内伸长的细菌。当不错很融会地看到细长的细菌时，在上部住手粗磨。底部的粗铣以300pa的电流出手，以大的逐步形状进行。当片层厚度达到1.5 μm时，将铣削电流改为100 pA，直到片层厚度达到~0.8 μm。尔后，细磨主要蚁合在< 50 pA的底部。用电子束在5kev和13pa下监测铣削历程。临了对薄片的两侧进行精铣处理。随后用铂(15 mA， 10 Pa， 10 s)溅射涂覆栅格，以增多研磨薄片的导电性。栅格通过传送梭系统从FIB仪器中传送，并储存在液氮中(SubAngstrom， Pin型栅格盒)，以便进一步数据采集或立即由CLEM再行阐明，以正笃定位gbp1包被细菌。
低温et和图像处理欺诈配备300 kV场辐照枪、Volta相板(相移约为1/2 pi)、Quantum柱后能量滤波器(20 ev狭槽)和Gatan K2/K3峰顶径直探伤相机的Titan Krios G2透射电子显微镜(Thermo Fisher Scientific)采集fib -铣削薄片样品的层析成像数据。咱们开首将平台导航到薄片，并在中等放大(2250倍)下采集蒙太奇;咱们使用ImageJ将TEM蒙太奇与第二个CLEM拍摄的舆图相通。薄片上的三个冰千里积物和一个双膜囊泡被用作掩盖这两张舆图的共同象征。其中一个收效的GFP信号指标位于最大的冰千里积物下方，围聚片层旯旮。用荧光信号将台移至指标物右侧，采集歪斜序列。使用SerialEM软件以近焦剂量分馏模式拍摄图像。得到的物理分辨率为0.45 nm/pixel。总剂量为80 e/? 2在33张歪斜图像中进行散布，歪斜方法为3°，掩盖角度为39°至-57°，以一语气数据采集形状从-9°出手第一个歪斜系列。小型电板的数据集接受剂量对称神情，不使用相位板。渺小胞样品的歪斜系列以0.14 nm/像素的物理分辨率从0°出手，掩盖角度范围为51°至-51°，增量为3°，总剂量为100 e/? 2．
采集的剂量分馏数据进行开通改造，以生成漂移改造的图像堆栈文献。使用IMOD的补丁追踪功能对堆栈文献进行对皆。接受同步迭代重建时期(SIRT)，欺诈Tomo3D对排列好的堆叠文献进行三维层析图重建。为了重建盒状层析图，将对皆的歪斜序列缩放到3.6 nm行为像素大小。使用IMOD进行层析成像。层析图的名义画图使用EMAN2.23，并用UCSF嵌合体进行细化。简而言之，对于核糖体，接受模板匹配计谋来笃定系数核糖体的坐标和场所。一种哺乳动物80S核糖体结构(EMD-3418)由Volta相板冷冻电镜测定，而细菌核糖体结构(EMD-0076) ( 52)低通滤波至20 ?，并缩放至3.6 nm/体素以匹配层析图。欺诈EMAN2.3对膜、囊泡和GBP1包被特征进行分割。3型分泌系统(T3SS)针复合物的低温电镜图 鼠伤寒和尚氏菌(emd - 11781) ( 53)缩放到3.6 nm/体素，并拟合到断层图中T3SS的位置。
Subtomogram平均使用TomoSegMemTV和PySeg包进行亚层图分析。对于出手膜分割，11张断层图来自 扫描纯正显微镜 ?心数据集和27个断层图 扫描纯正显微镜 ΔwaaG::pBAD-ftsZ接受TomoSegMemTV ( 54)。欺诈PySeg包基于碎裂莫尔斯表面(Discrete Morse theory)对膜上的粒子进行追踪和考中。 55)。粒子垂直于膜的出手场所由PySeg测定。将拾取的粒子坐标乘以4，得到CTF改造和权值反投影重建层析图中粒子坐标信息，分节系数为2。根据外膜(OM)的特征索取亚层图，并使用Relion软件包v3 ( 56）.
在OM排列高超后，在PySeg中进行一般分类功能以区分膜和非膜特征。高慢膜特征的类通过在膜的顶部应用圆柱形掩模合并为进一步的一般分类。分类终结高慢，膜上的GBP1的额外密度导致获取21，587个颗粒，用于Relion包进一步拘谨细化和分类。鄙人一步的Relion分类中，使用分子掩膜进行拘谨细化，平均4个类别，得到12，858个颗粒，用于去除GBP1的相通密度(图S8)。在后期处理历程中，最终的密度图是用分辨率为-1000的b因子和10 ?的低通滤波器生成的。二聚体和单体掩模的分辨率估量和傅立叶壳联系性过头限度如图S9所示。
为了对mRFP-GBP1的全涂层复合物进行距离检测，通过IMOD画图等高线手工分割OM和GBP1密度。欺诈Mtk函数检测GBP1 GTPase结构域密度与LPS外叶密度之间的最短距离。11，889个GBP1原体存在于野生型LPS的?minD渺小胞上;12487个GBP1原体存在于具有o抗原和外核截断LPS的?waaG小型细胞上;接受Graphpad Prism9试剂盒检测并分析了6107种GBP1原变成物在?waaG外膜囊泡(OMV)上的抒发。为了检测mRFP-GBP1在小型细胞和omv上的洗膜复合物的距离，使用IMOD手动画图3D层析图中的GBP1密度。欺诈EMAN2.23对清洗后的小型细胞和清洗后的OMV进行神经蚁集分割，并由UCSF Chimera进一步细化。
东说念主类GBP1的筹商模子咱们使用AlphaFold2来瞻望东说念主类GBP卵白眷属的功能同源物。值得注视的是，GBP5卵白(AF-A0A2K5PG15)发扬出一个细长的构象，雷同于东说念主类GBP1亚断层图平均中高慢的一些结构特征。最近的预计标明，枯竭C端的GBP5不错在GDP存在的情况下变成二聚体。淌若 3 -(pdb id 7e5a)。
基于截断的二聚体GBP1，咱们构建了一个示意二聚体GBP1激活情景的伪模子。开首，咱们欺诈Chimera软件包中的MatchMaker功能对东说念主类GBP1单体x射线晶体结构(6K1Z)的n端结构域和MD区域进行了比对;与GBP5二聚体(PDB ID 7E5A)的一个单体亚基比拟，它高慢了沿GTPase结构域轴的147°旋转和-14.7 ?位移。然后，咱们使用Chimera将GBP1的c端区域与瞻望的GBP5单体(AF-A0A2K5PG15)对皆。临了，通过AlphaFold2构建灵通GBP1构象的伪模子，并使用Chimera将其对接到咱们的低分辨率平均GBP1结构亚层析图中。它得到了细长的GBP1单体和二聚体模子，与咱们的单体和二聚体掩膜获取的自然结构相对应。
减少GBP1拥堵的礼貌洗涤方法重组包被复合物后，咱们通过14000离心采集未象征的GBP1包被小型细胞 g室温下静置5分钟(Eppendorf离神思5420，SN， 5420JQ303731)。将微球在包衣缓冲液[50 mM HEPES (pH7.5)， 150 mM NaCl， 1 mM MgCl]中洗涤 2轻轻地移液10次。然后通过离心再次采集gbp1包被的小型细胞，并进行疏通的洗涤处理。再重复一次，系数30次移液管赞助洗涤和去除开释的GBP1。然后将包被的小型细胞溶化在包被缓冲液中，准备用于冷冻et样品制备。该方法被说明是高效的，根据分段层析成像系列的径直计数，将拥堵度从每微小细胞约12，000 GBP1分子缩小到每微小细胞约100至120分子(>100倍损耗)。
Ni-NTA-nanogold标签含有六个组氨酸残基的His标签(His 6)与GSG聚首器会通到GBP1的N端。净化他的 6-GBP1在涂膜缓冲液顶用1 mM GTP稀释至2 μM，与细菌渺小胞悬浮液搀杂，如重组实验所述。在全涂层变成后，细胞悬浮液在6200下离心 g将含有细菌小型细胞和GBP1包被的微球溶化在阻断劝诱缓冲液(20 mM Tris-HCl， 150 mM NaCl， 0.1% Tween 20， 5% BSA， 1mM MgCl2)中，室温孵育10分钟。在阻断劝诱缓冲液中加入稀释1:10的1.8 nm Ni-NTA-Nanogold beads (Nanoprobes)，孵育10 min。6200离心 g用50 mM Tris-HCl、100 mM咪唑、1 mM MgCl2、0.1% Tween 20和300 mM NaCl (pH 7.4)洗涤3次。临了将渺小胞颗粒溶化在涂层缓冲液中，并转变到发光碳涂层铜网格上，用于低温et样品制备。
二硫交联试验为了测试GBP1的灵通构象模子，咱们接受了半胱氨酸替代计谋进行交联。选拔6个存在于GBP1 α7螺旋中间结构域且面向GED结构域α12螺旋的残基(glu389、Ile-369、glu366、Ile-365、Arg-362和glu361)行为潜在的Cys-Cys对。咱们测量了上述选拔的残基与相邻残基(Lys-520、Ser-523、Glu-526、His-527、Gln-530和Glu-533)在GED结构域α12上的Cβ原子之间的距离，并选拔了距离最近的残基行为交联候选者(间距在2 ~ 7埃之间)。将这些残基突变为半胱氨酸后，咱们径直不雅察到它们靶向细胞质 Stm在celllo(无花果。S13A， B)。这证实了莫得显著的结构改变会插手指标。咱们选拔中间的R362C-E526C突变体中Cys-Cys键间长度最短的突变体(2 ?)制作重组RFP-GBP1，用于径直无细胞包衣实验。在DTT(一种还原剂)存在或不存在的情况下，通过体外重构试验对其进行了检测。具体来说，是ys配对的GBP1 R362C-E526C经mRFP象征纯化后与细菌(OD = 0.1)搀杂，用150 mM NaCl， 1 mM MgCl包被缓冲液(HEPES缓冲液) 2pH 7.4)。通过在涂层缓冲液中加入终浓度为1mm的DTT，在还原条目下进行重构分析。
硅卵白序列分析对于与其他联系gtpase比拟，东说念主类GBP1中的脂质劝诱基序，使用最大似然方法和基于JTT矩阵的模子推断进化树历史。从10，000个重复中推断出一个bootstrap共鸣树来代表所分析的分类群的进化史。在< 50%的指引复制中复制的分区对应的分支被崩溃。通过对JTT模子估量的两两距离矩阵应用Neighbor-Join和BioNJ算法自动获取启发式搜索的出手树，然后选拔对数似然值较优的拓扑结构。接受碎裂Gamma散布对5类(+G，参数= 2.8088)位点间的进化速率各异进行建模。在MEGA X中进行了进化分析。
统计数据数据分析接受GraphPad Prism 9.1.1软件。Excel v16.54软件。除非另有说明，统计学显赫性是由 tBonferroni检修(双尾)或单因素方差分析(Dunnett多重比较检修) 因果测试。